近日🦉，Horticultural Plant Journal在線發表了趙建軍/李君團隊題為“An efficient and universal protoplast-based transient gene expression system for genome editing in Brassica crops（一種高效通用並適用於基因編輯的芸薹屬原生質體瞬時基因表達系統的建立）”的研究論文。 

芸薹屬是十字花科中最重要的一個屬🤷🏻‍♀️，包含多種蔬菜和油料作物✋🏿，對其品質進行遺傳改良具有重要的意義。基因編輯作為新一代生物育種的關鍵技術，被廣泛應用於多種作物的遺傳改良🗜。開發或者利用基因編輯編輯技術時，需要對基因編輯工具進行迭代測試或者對靶位點的活性進行驗證。原生質體瞬時基因表達體系具有操作簡單、轉化周期短🤽🏽‍♀️🫰🏽、轉化效率高等優點，因此可以快速評估芸薹屬作物CRISPR/Cas9基因編輯系統中靶位點的編輯效率。

在芸薹屬蔬菜作物中，只有少量原生質體瞬時基因表達體系的報道，而且製備的原生質體細胞活力以及轉化效率相較於其他物種均較低。本研究以大白菜和甘藍為材料，對影響原生質體製備和轉化效率的因素進行系統優化，以期在芸薹屬蔬菜作物中建立一個高效通用的原生質體瞬時基因表達體系（protoplast-based transient gene expression system, PTGE）。 

通過對影響大白菜原生質體製備的因素（如取材大小💿、酶解時間🔞、酶解液中甘露醇濃度）進行優化，發現以長度2 cm的真葉為材料🧏🏿，當使用含0.6 mol · L^-1甘露醇的酶解液酶解6 h時原生質體細胞產量為4.7×10⁵· g^-1 FW，細胞活力可達97%，表明在大白菜中建立了高效的原生質體製備體系。

圖1 大白菜原生質體製備條件的優化

通過對影響原生質體瞬時轉化效率的因素進行優化🧖‍♀️，發現MMG溶液中的甘露醇濃度是影響轉化效率的關鍵因素，當甘露醇濃度為0.3 mol · L^-1時，原生質體的轉化效率提升2.5倍。使用20 µg質粒，PEG中含0.2 mol · L^-1氯化鈣，轉化15 min（含37°C熱處理6 min），轉化效率可達86%。上述結果表明🍈，在大白菜中成功建立高效的原生質體瞬時轉化體系🤹🏿，並且該體系在不同大白菜品種中均表現出較高的轉化效率。

圖2 不同轉染條件對大白菜原生質體轉染效率的影響

進一步將該體系應用到芸薹屬其他物種。在甘藍中🕵🏻‍♂️，使用長度1.5 cm的真葉，利用含0.6 mol · L^-1甘露醇的酶解液酶解6 h，原生質體產量和活力達到最高➝，分別為4.9 × 10⁵· g^-1 FW和95%。使用20 µg質粒🫳🏼，PEG中含0.3 mol · L^-1氯化鈣，室溫轉化15 min，甘藍原生質體的轉化效率可達69%➡️。另外💆‍♂️，使用相同的原生質體製備和轉化條件，不結球白菜🛏🕵️‍♂️、芥藍和蕪菁原生質體的轉化效率也均超過了50%👨‍🦳，表明該體系可以廣泛應用於芸薹屬多個物種☸️🧑🏽‍🏫。

圖3 PTGE在其他芸薹屬中的應用

為了驗證該體系是否可以應用於CRISPR/Cas9基因編輯載體的活性驗證，我們在大白菜AOP2基因🧏🏽、甘藍DMR6基因和不結球白菜PDS基因上設計基因編輯靶位點。將構建完成的基因編輯載體通過PTGE分別轉化對應三個芸薹屬物種的原生質體，通過PCR、PCR/RE及Sanger測序證實在三個基因的靶位點均發生了基因編輯。表明該體系可以應用於多個芸薹屬物種的基因編輯載體的活性驗證。

圖 4 CRISPR/Cas9介導的芸薹屬基因突變檢測

本研究通過對大白菜原生質體的製備和瞬時轉化條件進行系統性的優化和探索👨🏿‍🔧，率先發現低滲透壓處理原生質體細胞可以顯著提高原生質體的轉化效率，成功建立了一套高效通用的芸薹屬原生質體瞬時基因表達體系（PTGE），應用本研究建立的PTGE在多個芸薹屬物種中成功驗證了基因編輯載體的活性，為芸薹屬物種的品質改良提供了重要的技術支持。

圖 5 基於原生質體的瞬時基因表達系統(PTGE)示意圖

2020級碩士研究生余瀟瀟、本科生於金泰和青年教師盧銀為該論文的第一作者🚐，趙建軍教授、李君教授和李巖副教授為該文的通信作者。李文靜、霍貫中和張珺參與了本研究。該研究獲得國家自然科學基金重點項目、河北省自然科學基金、河北省重點研發計劃和EON体育4啟動經費的資助。

論文鏈接🛌：https://doi. 10.1016/j.hpj.2024.06.001